抗体药物因其特异性高，治疗效果显著，具有优越的药代动力学等特性，在生物药市场中举足轻重。根据Frost & Sullivan的统计预测，到2030年全球抗体药物市场规模预计增至4,431亿美元。随着抗体药的需求逐步扩大，抗体发现及筛选技术的发展势在必行。目前抗体技术应用较普遍的有杂交瘤技术、噬菌体展示技术和B细胞克隆技术。技术各有千秋，本期我们重点聊聊单B细胞抗体技术。
1、什么是单B细胞抗体技术？
单B细胞抗体技术是指利用一个B细胞只含有一个功能性重链可变区DNA序列和一个轻链可变区DNA序列，以及一个B细胞只产生一种特异性抗体的特性，从免疫动物组织或外周血中分离特异性B细胞，然后再通过单细胞PCR技术从分泌单个抗体的B细胞中扩增重链可变区和轻链可变区DNA序列，最后在哺乳动物细胞内表达获得具有生物活性的单克隆抗体。目前，单B细胞抗体技术已广泛应用于病原微生物感染、肿瘤、自身免疫性疾病和器官移植等方面，并显示出了独特的优势和良好的应用前景。
2、单B细胞抗体技术的优势有哪些？
传统的杂交瘤技术抗体，开发周期长，包括免疫通常要8个月左右。而且受杂交瘤融合率的限制，整个B细胞群中只有一小部分B细胞完全融合，获得的阳性克隆少，不适合用于大型抗体库进行全面筛选。对于噬菌体展示技术而言，尽管其库容量很大，但是其重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的配对通常依赖于随机组合，形成的大部分都是非自然的VH-VL抗体配对。而单B细胞抗体技术，作为继杂交瘤技术与噬菌体展示技术之后的新一代抗体开发技术，拥有开发周期长、阳性克隆多、全人源、需要的细胞量少等优势。最重要的是，通过单B细胞抗体技术获得的抗体能确保轻链和重链天然配对，这在抗体开发是至关重要的。
3、单B细胞抗体技术的流程是什么？
单B细胞抗体技术整个流程主要有五步，包括B细胞富集、单个B细胞筛选、抗体基因测序与分析、重组抗体表达和抗体功能验证。
Figure 1. the process of single B cell antibody technology
B细胞富集，B细胞一般来源于外周血，可以通过静脉采血后离心分离白细胞层来获得B细胞。
单个B细胞筛选，也称为单个B细胞分离或阳性克隆筛选，指的是从混合的B细胞群体中分离出单个B细胞，是单B细胞技术中最关键的步骤。根据样本类型的不同，单个B细胞分离可以分为随机分离和抗原特异性分离。随机分离是指只需要分离B细胞，常用的分离方法有显微操作、激光捕获显微切、荧光激活细胞分选法。这类分离适用于抗原特异性抗体浓度高的样本（例如来源于疫苗接种者或患者的血样）。抗原特异性分离指需分离抗原特异性B细胞，常用的分离方式包括荧光标记抗原多参数细胞分、抗原标记磁珠分选法、微雕法、以及细胞微阵列芯片。这类分离适合抗肿瘤抗体、自身免疫抗体等特异性抗体含量较低的情况。
在获得单个B细胞后，需对其抗体基因进行测序及分析。如前所述，这一步可以通过单细胞PCR技术扩增重链可变区和轻链可变区DNA序列，然后进行测序。测序完成后可通过生物信息学对测序数据进行分析，包括基因序列比对、突变鉴定和亲和力评估等。
通过上一步的抗体基因测序与分析，通常会选择亲和力较好的抗体基因进行重组抗体表达。具体如何选择需要根据自己的实验设计来。在生物药研究领域，常用于重组抗体表达的表达系统为哺乳动物细胞表达系统。
抗体基因重组表达后，需要进一步对其功能进行验证，确定其生物活性及抗原结合能力，常用的验证方法包括流式细胞术、酶联免疫吸附和免疫组化等。
4、缔码基于单B细胞技术的兔单抗发现平台
缔码生物基于单B细胞技术的创新型兔单抗发现平台，其创新点主要集中在克隆抗体基因之前对单个B细胞进行体外培养。与传统的使用单细胞PCR技术相比，缔码克隆的数百个B细胞的抗体基因来自于单个亲本B细胞。这种方法显著提高了克隆的成功率，使缔码能够从免疫动物中获得更多的阳性先导抗体序列。通常情况下，一只兔子的B细胞总数可达3-5×10^8个，从中可获得的分泌特异性抗体B细胞克隆总数可达上万个。该平台利用兔单抗的优势，可提供从抗原合成到抗体功能验证的一站式服务，时间周期短，可直接获取抗体基因序列和功能蛋白抗原。
平台流程
Figure 2. 缔码单B细胞兔单抗发现流程
案例展示
此外，针对热门药物靶点，缔码还制备了B细胞种子库。缔码单克隆抗体B细胞种子库是由接受免疫的兔子中分离的B细胞构建而成，这些B细胞已经预先通过ELISA和FACS验证，可以特异性结合抗原蛋白。缔码单克隆抗体B细胞库主要用于筛选先导抗体分子。筛选出的先导分子有着多样的CDR序列和良好的可成药性。目前有相应种子库的靶点，最快35天获得先导抗体。截止到2023年底，近5年的时间，缔码完成407个新靶点B细胞种子库的制备，275个药物靶点先导抗体分子开发。除了兔单抗，缔码还搭建了鼠单抗、羊单抗和纳米抗体开发平台，欢迎合作垂询。
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