1. 关于Synthetic Nanodisc
传统的MSP纳米盘中的脂质成分可能与天然细胞膜的脂质成分不同，导致膜蛋白的某些特性与原生膜环境下有所偏差，因此有一定的局限性。缔码研发的Synthetic Nanodisc，能直接从完整的细胞中制作，该平台利用具有疏水和亲水双重特性的物质作为稳定剂，稳定剂朝向内部脂层的疏水面可将膜蛋白整合到Nanodisc中，维持膜蛋白的天然空间构象和活性。同时，朝外的亲水面使得Nanodisc在水溶液中具有很高的溶解度和稳定性。在这个过程中，使用合成高分子具有双重功能。首先，它溶解细胞膜，类似于洗涤剂，同时利用天然细胞磷脂在膜蛋白周围形成纳米盘结构。此外，缔码使用哺乳动物表达系统来制备膜蛋白，这可确保蛋白在结构、功能和翻译后修饰方面与天然对应物非常相似，使其成为生物化学和生物医学领域广泛应用的理想工具。接下来我们以近期较火热的GPCR靶点GPR75为例子，讲述Synthetic Nanodisc这一技术是如何帮助我们更有效地表达和纯化GPCR蛋白。
Left: MSP Nanodisc; Right: Synthetic Nanodisc)
2. 关于GPR75
2.1 GPR75结构
GPR75又称为G蛋白偶联受体75，是G蛋白偶联受体家族（GPCR）中的一员，属A类GPCR。GPCR是细胞表面受体中最大的家族，负责细胞识别各种外部刺激，包括激素，神经递质，脂质等。这个家族的受体均有7个跨膜结构域（TM1-7），由三个细胞外环（ECL1-3）和三个细胞内环（ICL1-3）连接。其中第三细胞内环（ICL3）的结构非常灵活，长度变化很大。ICL3可与G蛋白相互作用，而G蛋白是细胞内信号转导所必须的。有研究发现ICL3在结晶的GPCR中是无序的，因此为了提高GPCR结晶的稳定性，ICL3通常被可溶性蛋白质替代。
(Structural Simulation of GPR75 Protein)
2.2 GPR75与生物医药开发
研究表明GPR75在肥胖、癌症和代谢综合征等许多疾病中发挥重要作用。迄今为止，已检测到GPR75的三种配体，包括20-HETE、CCL5和RANTES。有研究发现20-HETE 通过 GPR75 触发包括 PI3K/Akt 和 RAS/MAPK 在内的信号通路，导致前列腺癌细胞更具侵袭性表型。此外，PI3K/Akt 和 RAS/MAPK 信号通路激活 NF-κB，这在癌症发展的各种通路（例如增殖、迁移和凋亡）中具有重要意义。研究结果表明，抑制人类 GPR75 会导致胰岛素敏感性和葡萄糖耐量增加，以及体内脂肪储存减少。根据这些发现，GPR75可能成为肥胖、代谢综合征和癌症等疾病药物治疗的潜在靶点。
但是像GPCR这种典型的膜蛋白，其特有的疏水性的螺旋结构嵌入细胞膜中，使得GPCR在水溶液中不稳定，且在大多数表达系统中，GPCR的表达量较低。此外，GPCR的构象不稳定，会根据其配体的结合状态发生变化，在纯化过程中，不同的构象会影响结合亲和力。基于其膜蛋白的特性、低表达量、构象变化等多方面因素给研究者们在纯化蛋白时带来诸多挑战，缔码开发了多种解决方案以助力研究者们更加快速便捷的获取高纯度，高稳定性的具有天然构象的膜蛋白。下面让我们一起了解下这些解决方案。
3. GPR75-Nanoodisc多种解决方案
3.1 Flag标签
Flag标签是一种短的、常见的肽序列（通常为DYKDDDDK），可以通过Anti-Flag抗体进行高效的免疫捕获。其在蛋白表达和纯化中具有以下优势：
增强纯化的特异性：由于抗Flag抗体具有较高的亲和力，能够特异性地与标签结合，从而减少非特异性结合的杂质。
对蛋白功能的干扰较小：Flag标签相对较小，不容易影响膜蛋白的结构和功能，尤其是在跨膜蛋白的纯化过程中，膜蛋白的结构与功能通常比较敏感。
纯化效率高：Flag标签可以通过专门的抗体（如Anti-Flag抗体）进行亲和纯化，整个过程比较简单。这对于跨膜蛋白，特别是对于那些在膜中非常稳定的蛋白，能够提供一个高效、稳定的纯化手段。
广泛应用于多种表达系统：Flag标签可以在大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞等系统中表达。无论在什么系统中表达的膜蛋白，Flag标签都可以有效地与抗体结合，从而实现纯化。
高灵敏度的检测：由于Flag标签的高度特异性，使用抗Flag抗体可以对表达的膜蛋白进行。即使是低表达量的膜蛋白也能通过抗Flag抗体进行有效的检测和富集。
基于上述优势，Flag标签也成为膜蛋白纯化的常用标签。
Human GPR75 full length protein-synthetic nanodisc (Cat# FLP100031)
Left: Elisa plates were pre-coated with Flag Tag GPR75-Nanodisc and anti-GPR75 monoclonal antibody (DMC100368); Right: WB analysis of Human GPR75-Nanodisc with anti-Flag monoclonal antibody.
3.2 MBP标签
MBP（Maltose Binding Protein，麦芽糖结合蛋白）标签是一种常用的融合标签，广泛应用于膜蛋白的表达和纯化过程中。其在蛋白表达和纯化中具有以下优势：
提高溶解性：由于膜蛋白的疏水性和结构复杂性，，容易形成包涵体，而MBP通过提供一个疏水性较低的外部结构，可以促进膜蛋白在溶液中的稳定性，减少包涵体的形成。
增强表达量：MBP标签能够改善目标膜蛋白的折叠和溶解性，因此能显著提高目标蛋白的表达量。很多膜蛋白在没有标签的情况下表达量较低，而与MBP融合后，可以在大肠杆菌等表达系统中得到高水平的表达。
简化纯化过程：MBP标签可用于亲和层析纯化。在纯化过程中，MBP与麦芽糖亲和结合，可以使用含麦芽糖的树脂轻松地纯化融合蛋白。这一纯化过程简便，且具有较高的纯度。此外，通过MBP标签的特异性结合，能够有效地去除大多数杂蛋白。
可去除性：MBP标签可以通过特定的酶切去除，常用的酶包括胰蛋白酶和His标签蛋白酶。这为下游实验提供了更纯净的目标蛋白，尤其是当膜蛋白的功能和结构与标签干扰时，去除MBP标签后能够恢复目标蛋白的生物学活性。
稳定性和折叠支持：MBP标签能够在某些情况下帮助膜蛋白正确折叠，从而保持蛋白的功能和结构稳定性，防止在纯化过程中蛋白降解或失活。这对于结构解析（如X射线晶体学或冷冻电镜）以及功能研究至关重要。
Human MBP-GPR75 full length protein-synthetic nanodisc (Cat# FLP110031)
Left: Human MBP-GPR75-Nanodisc with N-MBP Tag, C-Flag Tag on SDS-PAGE; Right: Elisa plates were pre-coated with N-MBP Tag, C-Flag Tag MBP-GPR75-Nanodisc and anti-GPR75 monoclonal antibody (DMC100368).
3.3 Strep标签
Strep标签（Streptavidin标签）是一种常用的亲和标签，基于Streptavidin和其配体生物素的高亲和力作用，常用于蛋白的纯化和捕获。Strep标签在膜蛋白表达和纯化中的优势包括：
高亲和力纯化：Strep标签与Streptavidin树脂具有非常高的亲和力（Kd ≈ 10^-14 M），能够在较低浓度下有效纯化目标蛋白。这使得在不干扰膜蛋白天然构象的情况下，获得高纯度的目标蛋白。
标签体积小：Strep标签较小（约8 kDa），对膜蛋白结构和功能干扰较少，无需去除标签即可用于下游实验。
易于检测：Strep标签可以与标记的Streptavidin（荧光、酶等）结合，便于检测和分析膜蛋白的表达和纯度。这在膜蛋白表达的监控和下游应用中非常有用。
适用于多种检测系统：Strep标签蛋白非常适用于在ELISA，SPR或BLI等检测系统中蛋白质的固定和检测。
Human GPR75-Strep full length protein-synthetic nanodisc (Cat# FLP120031)
Left: Human GPR75-Strep-Nanodisc, C-Flag&Strep Tag on SDS-PAGE; Middle: Elisa plates were pre-coated with C-Flag&Strep Tag GPR75-Strep-Nanodisc and and anti-GPR75 monoclonal antibody (DMC100368); Right: WB analysis of GPR75-Strep-Nanodisc with anti-GPR75 monoclonal antibody (DMC100368).
1.1 β2AR&BRIL融合蛋白
β2-肾上腺素受体（β2AR）是β-肾上腺素受体家族的一员，属于GPCR类。纯化过程中，由于GPCR在膜中的功能和构象依赖于膜脂质的环境，因此保持膜蛋白的稳定性和功能是关键问题。研究发现，改变N端残基可能导致受体在膜中的嵌入方式发生变化，从而改变受体与配体结合的亲和力。GPR75和β2AR都属于G蛋白偶联受体，且它们在结构上具有一定的相似性，通过将N端替换为β2AR的序列，可增加GPR75表达量。
BRIL来源于细菌细胞色素b562（cytochrome b562），其具有一个紧密折叠的α螺旋结构，突变使其更加稳定，并且对温度和溶液环境具有较高耐受性。BRIL具有双重特性：在血红素结合区域高度灵活，但在远端部分具有非常稳定且刚性的核心，这确保了快速折叠动力学和折叠稳定性。这种双重特性使BRIL成为在膜蛋白的螺旋之间环区域进行融合的理想伴侣，因为它可以轻松地适应两种蛋白质的螺旋之间的轻微横向错位，同时有助于折叠动力学和稳定性。因此，通过将BRIL序列替换掉原来的ICL3环（237-306），以增强受体的稳定性。
Human β2AR-GPR75-BRIL full length protein-synthetic nanodisc (Cat#FLP110031A)
Left: Human β2AR-GPR75-BRIL-Nanodisc, Flag Tag on SDS-PAGE; Right: Elisa plates were pre-coated with Flag Tag β2AR-GPR75-BRIL-Nanodisc and anti-Flag monoclonal antibody.
4. GPR75靶点系列产品
为助力生物医药开发，缔码开发了一系列针对GPR75靶点的产品，涵盖胞外域重组蛋白，全长膜蛋白，自主研发的单克隆抗体，生物素和PE荧光标记抗体以及稳转细胞株。除了现有的产品，缔码还可提供专业的蛋白（不同种属/标签）和抗体（人源化/亲和力成熟）定制服务以满足不同客户的需求。此外，我们还制备了GPR75靶点的单B细胞种子库，可以在短时间内（~28天）快速地筛选出先导抗体分子。更多详情，欢迎垂询。
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