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全长膜蛋白平台:Nanodisc时间:2022-08-16


多跨膜蛋白由于存在跨膜区的疏水结构域,在体外容易聚合,使得其在体外难以保持其正确的天然空间构象,从而影响蛋白的正常功能。因此如何让膜蛋白在体外仍保持其天然构象,是膜蛋白表达纯化过程中面临的重要问题。另外如何提高蛋白纯度,也是需要解决的问题之一

Nanodisc为这些问题提供了一个可行的解决方案。

Nanodisc介绍

Nanodisc中文名称为纳米磷脂盘或纳米圆盘,该平台利用具有疏水和亲水双重特性的物质作为稳定剂,稳定剂朝向内部脂层的疏水面可将膜蛋白整合到Nanodisc中,维持膜蛋白的天然空间构象和活性。同时,朝外的亲水面使得Nanodisc在水溶液中具有很高的溶解度和稳定性。

Nanodisc的优势

Nanodisc平台高效而温和地辅助膜蛋白的提取和保持其构象,为提取出来的膜蛋白提供一个稳定环境使它们继续工作,同时该平台能够获得的蛋白纯度更高,应用更广。使得进一步研究跨膜蛋白与拮抗剂,激动剂,G蛋白等其他配体的相互作用不再受限。

Nanodisc类型

这篇文章中,我们将详细介绍Nanodisc平台。

根据稳定剂的不同,可将Nanodisc分为不同类型: MSP nanodisc and Synthetic nanodisc.

MSP Nanodisc
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Synthetic Nanodisc
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MSP nanodisc

MSP nanodisc使用Membrane scaffold proteinsMSPs)作为稳定剂,包裹人工磷脂成分和跨膜蛋白,形成一个纳米圆盘。所形成的纳米圆盘的大小由所选用的MSPs决定。其制备过程通常有两种形式:

1. 组装溶解在去垢剂中的膜蛋白

在去垢剂存在条件下将膜蛋白纯化,然后添加MSPs和磷脂。膜蛋白MSPs和磷脂能够自发地组装成为nanodisc,去除掉去垢剂后可以通过尺寸排阻色谱或亲和纯化等方式来纯化。下图以A2AR蛋白为例,阐述具体过程。  

图片 Nanodisc的组装(数据来源:Probing Membrane Protein Assembly into Nanodiscs by In Situ Dynamic Light Scattering: A2A Receptor as a Case Study.)

2. Nanodisc与无细胞表达体系相结合  

将组装好的纳米圆盘加入到无细胞反应体系中。从表达质粒开始,膜蛋白可以在无细胞系统中产生自发整合到纳米圆盘中。

Synthetic nanodisc

合成纳米盘的组装起始于完整的细胞。它利用合成的聚合物溶解细胞膜,同时利用原生细胞磷脂在膜蛋白周围形成纳米盘结构。聚合物同时作为增溶剂和稳定剂。因此,不需要额外的去垢剂

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以下表格是两种Nanodisc的差异:

Synthetic Nanodisc

MSP Nanodisc

稳定剂

合成聚合物

膜支架蛋白

磷脂来源

细胞膜

人工磷脂

制备方法

合成聚合物溶解细胞膜

去垢剂膜蛋白自组装或无细胞表达体系

是否需要去垢剂

Synthetic Nanodisc的优势

1.省略了MSP nanodisc去垢剂以及磷脂的筛选过程,缩短了研发周期。

2. Synthetic Nanodisc使用的合成聚合物是非蛋白成分,相比较MSP纳米盘而言,具有更高的纯度。

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案例数据
01
GPRC5D full length protein-synthetic nanodisc

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Human GPRC5D-Nanodisc, Flag Tag on SDS-PAGE

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Elisa plates were added with Flag Tag GPRC5D-Nanodisc (0.5μg/per well) on an anti-Flag monoclonal antibody pre-coated (0.5μg/per well) plate. Serial diluted anti-GPRC5D monoclonal antibody (DME100090) solutions were added, washed, and incubated with secondary antibody before Elisa reading. From above data, the EC50 for anti-GPRC5D monoclonal antibody binding with GPRC5D-Nanodisc is 32.86ng/ml.

02
Claudin6 full length protein-synthetic nanodisc

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Human CLDN6-Nanodisc, Flag Tag on SDS-PAGE

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Elisa plates were added with Flag Tag CLDN6-Nanodisc (0.5μg/per well) on an anti-Flag monoclonal antibody pre-coated (0.5μg/per well) plate. Serial diluted anti-CLDN6 monoclonal antibody (BME100082) solutions were added, washed, and incubated with secondary antibody before Elisa reading. From above data, the EC50 for anti-CLDN6 monoclonal antibody binding with CLDN6-Nanodisc is 66.99ng/ml.


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